DZIWNY PRZECIEK PROTONÓW


Komórka aby żyć, potrzebuje energii. Musi tę energię jakoś pozyskiwać i gromadzić "na czarną godzinę". Komórki eukariotyczne czerpią ją w procesach oddychania, które z chemicznego punktu widzenia, sprowadzają się do reakcji utleniania czyli przenoszenia elektronów z cząsteczek zredukowanych substratów na utleniacz, którym niekoniecznie musi być tlen. Jednak oddychanie tlenowe (aerobowe) jest znacznie wydajniejsze od beztlenowego (anaerobowego). Wszystkie wyższe organizmy na Ziemi chętnie więc korzystają z jej bogatych zasobów tlenu, oddychanie beztlenowe pozostawiając tylko jednokomórkowcom żyjącym w środowiskach pozbawionych tego życiodajnego pierwiastka.
Na poziomie komórkowym, procesy oddychania zachodzą w niezwykłych organellach komórkowych - mitochondriach [zob. też tutaj]. W ich błonie wewnętrznej znajdują się m.in. 4 kompleksy białkowe, zwane łańcuchem oddechowym, z których 3 pełnią rolę pomp protonowych. To one wykorzystują energię, pozyskiwaną z etapowego przenoszenia elektronów w dół potencjału oksydoredukcyjnego (redoks), aż na końcowy akceptor - tlen, do przemieszczania protonów z wnętrza mitochondriów do przestrzeni międzybłonowej, co tworzy tzw. „siłę protonomotoryczną”, a mniej uczenie po prostu różnicę potencjałów i różnicę stężeń protonów (różnicę pH) po obu stronach wewnętrznej błony mitochondrialnej. Skutkiem tego wnętrze mitochondriów (macierz, matriks lub zupełnie z angielska matrix) jest zalkalizowane i ujemne w stosunku do środowiska, a wyrzucanie protonów na zewnątrz wymaga nakładu energii (stąd nazwa pompy i pompowanie protonów - trochę żargonowe, ale doskonale oddające istotę rzeczy). W typowych mitochondriach potencjał błonowy wynosi ok. 200 mV, a różnica pH nie przekracza jednostki. Jednak przechowywanie energii uzyskanej w czasie oddychania w postaci gradientu potencjału i stężeń H+ jest - na dłuższą metę - niemożliwe co najmniej z dwóch powodów: Pozyskana i zmagazynowana w formie siły protonomotorycznej energia jest więc przekształcana w postać chemiczną wiązań w cząsteczkach ATP. Te zaś syntetyzowane są z molekuł ADP i fosforanów (oznaczanych powszechnie symbolem Pi) przez białka - syntazy ATP zlokalizowane również w wewnętrznej błonie mitochondrialnej. „Siłą” napędową tej syntezy jest właśnie siła protonomotoryczna. W wielkim uproszczeniu dzieje się to tak. Protony płyną (teraz już samoistnie) w dół gradientu potencjału i stężenia poprzez kanały podjednostki strukturalnej syntazy ATP zwanej F0 przenikającej na wskroś dwuwarstwę lipidową. Po drugiej stronie błony gros ich energii jest wykorzystane do zmian konformacyjnych podjednostki syntazy oznaczonej F1. Białko F1 wyłapuje ze środowiska cząsteczki ADP i Pi, a zmiany konformacji powodują takie ich zbliżenie, że możliwe jest utworzenie nowej cząsteczki ATP, która następnie jest uwalniana do środowiska. Mamy tu pełną analogię do obwodu elektrycznego: pompy protonowe (baterie, prądnice) przepychają ładunki w górę różnicy potencjału, a te już samoistnie płyną przez syntazy ATP (obwód zewnętrzny z opornikami i silnikami) wykonując pracę tworzenia cząsteczek ATP. Dlatego mówi się często o obwodzie protonowym i używa do opisu zjawisk przekształcania energii terminologii rodem z elektrotechniki. Cały proces utleniania substratów pokarmowych i tworzenia cząsteczek ATP zwiemy fosforylacją oksydacyjną. Jeżeli w środowisku (dla mitochondriów środowiskiem jest wnętrze komórki) nie brakuje substratów i tlenu to proces ten może zachodzić bardzo intensywnie. Określa się go jako stan 3 oddechowy. Jeżeli zabraknie substratów np. ADP to ulega on zahamowaniu - mitochondrium przechodzi w tzw. 4 stan oddechowy. Opisane w wielkim skrócie sprzężenie transportu elektronów (oddychania) i syntezy ATP nosi nazwę mechanizmu chemiosmotycznego. W tym pobieżnym opisie wygląda bardzo prosto, wręcz banalnie, ale to za opracowanie i błyskotliwe uzasadnienie eksperymentalne tej teorii przyznano Peterowi Mitchellowi nagrodę Nobla.
Już nawet z tak uproszczonego opisu można wyciągnąć kilka wniosków: Właśnie z niską przewodnością błon mitochondrialnych dla protonów były problemy. W natywnych mitochondriach znajdujących się w 4 stanie oddechowym, a więc nie produkujących ATP, stwierdzano pewną - wcale nie tak małą - aktywność łańcucha oddechowego. Gdzie podziewała się uwolniona w tym procesie energia? Podejrzewano, że idzie na odbudowywanie siły protonomotorycznej, malejącej na skutek przenikania protonów przez lipidową fazę wewnętrznej błony mitochondrialnej, z pominięciem syntaz ATP. Nie do końca zgadzało się to z generalnymi postulatami teorii chemiosmotycznej i trochę przypominało noszenie wody dziurawym wiadrem. No bo jak to? Enzymy łańcucha oddechowego pracując „w pocie czoła” pompują protony po to tylko, by te bezproduktywnie przeciekały z powrotem. Przez długi czas przyjmowano jednak, że przeciek ten jest wynikiem uszkodzeń błony w procedurze izolacji mitochondriów z komórek. Przecież aby je wyizolować, trzeba było najpierw mechanicznie rozdrobnić tkankę, a potem oddzielić mitochondria przez wirowanie. Podpierano się przy tym znanym rezultatami doświadczeń wskazującymi na niską przepuszczalność jonów (np. jonów metali alkalicznych) przez lipidową fazę błon komórkowych oraz modelowych dwuwarstw lipidowych (wóczas jeszcze bardzo niedoskonałych). Wyniki te były zresztą zgodne z teorią stanowiącą, że jedną z głównych przyczyn takiej niskiej przewodności jonów powinna być mała - w porównaniu z wodą - wartość przenikalności dialektrycznej weglowodorowego rdzenia błony. Już z elementarnych rozważań wynika, że jony - szczególnie te o małych rozmiarach - muszą pokonać dużą barierę potencjału przy przejściu ze środowiska wodnego do lipidowego (jest to tzw. energia Borna, wzrastająca wraz ze zmniejszaniem się promienia jonu). Spodziewano się, że jony wodorowe - jako najmniejsze - będą musiały pokonać najwyższą barierę potencjału, która skutecznie zredukuje ich przenikalność.
W ciągu niemalże piętnastoleniej, chwilami dość zażartej, dyskusji nad teorią chemiosmotyczną doskonalono układy naśladujące błony biologiczne [zob. też tutaj i tutaj], głównie liposomy i bimolekularne błony lipidowe (BLM). W badaniach mitochondrów szczególnie przydatne okazały się tzw. cząsteczki submitochondrialne (SMP - z ang. SubMitochondrial Particles) będące odmianą liposomów jednowarstwowych z wbudowanymi białkami mitochondrialnymi. Pojawił się też ogólnie akceptowany model błony biologicznej, której matrycę stanowiła samoorganizująca się w środowisku wodnym dwuwarstwa lipidowa, a pomiary transportu jonów stawały się coraz dokładniejsze. Kationy alkaliczne nie sprawiły niespodzianek - potwierdziła się ich znikomo mała przenikalność. Wielkim sukcesem teorii Mitchella było też wykazanie w licznych eksperymentach, że znane od dawna rozsprzęgacze fosforylacji oksydacyjnej działają, w błonach modelowych, jako silne jonofory protonowe - protonofory czyli czynniki drastycznie zwiększające przewodnictwo H+ przez dwuwarstwy lipidowe.
Natomiast pomiary szybkości biernego transportu protonów przez lipidowe błony modelowe dały zaskakujące wyniki. W porównaiu do bardzo słabo przenikliwych jonów metali alkalicznych, współczynnik przenikania jonów H+/OH- był o 5 do 8 rzędów wielkości (100 000 do 10 000 000) wyższy! Zaobserwowano też inne interesujące anomalie. Wszystko to sugerowało nietypowy mechanizm transportu H+/OH-, niedostępny dla innych jonów. Po krótkotrwałym zamieszaniu (sugerowano błędy popełniane przy pomiarach i skrupulatnie sprawdzano możliwości zmierzenia artefaktów) zdecydowanie szybszy bierny transport protonów przez dwuwarstwy lipidowe stał się uznanym, choć do dziś nieco kłopotliwym faktem doświadczalnym. Miało to jednak i swoje dobre strony. Można było teraz przypisać aktywność oddechową w stanie 4, częściowemu, słabemu zwieraniu obwodu protonowego przez lipidową fazę błony. Tworzyło to dość spójną całość: mitochondria muszą oddychać nawet w stanie spoczynku, bo ich błony wewnętrzne są nieszczelne akurat dla protonów. Pozostawało co prawda pytanie treści trochę filozoficznej: dlaczego natura tak to urządziła, że na pewnym etapie przetwarzania energii przez komórkę jest ona "przechowywana" w postaci gradientu stężenia jonów akurat najbardziej przenikliwych, ale przecież nie wszyscy mają usposobienie filozoficzne. Zawsze można było zadowolić się odpowiedzią, że w fizjologicznych pH (7-8) stężenie kationów wodorowych jest bardzo małe (rzędu wielkości 10-7 mol/litr) więc i prądy protonowe są niewielkie - znacznie mniejsze niż strumienie H+ transportowanych przez białka, i... przestać myśleć o sprawie.
Niestety, jak to w życiu bywa, „wszystko się zgadzało z wyjątkiem kasy”. W ostatnim dziesięcioleciu wykonano wiele dokładniejszych, porównawczych pomiarów przecieku protonów w natywnych mitochondriach pochodzących z różnorodnych komórek, różnych gatunków zwierząt. Ich wyniki zestawiono z przewodnictwem protonowym modelowych błon (liposomów) formowanych z lipidów wewnetrznych błon mitochondrialnych (zadbano oczywiście o to by transport odbywał się w podobnych warunkach). Wyniki tych wszystkich badań były frapujące: Chcąc wytłumaczyć pierwszy z tych faktów próbowano podważyć wyniki doświadczeń z liposomami utworzonymi z lipidów wewnętrznej błony mitochondrialnej (a wiec mających taki sam skład lipidowy). Istotnie, dwuwartwy lipidowe wewnętrznej błony mitochondrialnnej i liposomów o takim samym składzie lipidowym mogą różnić się właściwościami m.in. transportowymi przynajmniej z kilku powodów: Jakkolwiek wszystkie powyższe czynniki mogą mieć znaczenie, to upatrywanie w tym rozwiązania problemu jest próbą raczej rozpaczliwą. Narzucał się wniosek, że musi istnieć jeszcze jakiś inny mechanizm rozpraszania siły protonomotorycznej. Jaki, tego na razie nie wiemy. Wracając do obrazowego porównania z wiadrem wody, to nie dość, że jest ono dziurawe, to jeszcze jakby specjalnie niezręcznie niesione, tak by woda rozchlapywała się na wszystkie strony. Co skłania naturę do tak znacznych, na pierwszy rzut oka nawet bezsensownych wydatków energetycznych? I dlaczego 2 miliardy lat ewolucji aerobowego przekształcania energii nie doprowadziło do minimalizacji tych strat? Przecież organizmy, którym udałoby się zredukować te ubytki energetyczne uzyskałyby ogromną przewagę ewolucyjną. Odpowiedzi na to pytanie również nie znamy, ale pojawiło się już szereg hipotez. Postuluje się m.in., że przeciek protonów może pełnić następujące funkcje: Spośród tych wszystkich możliwości, przeanalizowanych skrótowo w ramkach, szczególnie interesująca wydaje się ostatnia.
Copyright © 1996-2002 A.F.